Nghiên cứu đặc điểm hệ gen và xác định genotype (genotyping) một số virus RNA gây bệnh truyền nhiễm ở gia cầm tại Việt Nam

Đề tài nhằm hoàn thành giải mã được toàn bộ hệ gen/các gen quan trọng của các chủng virus Gumboro (IBDV), virus Newcastle (NDV) và virus viêm phế quản truyền nhiễm (IBV) phân lập tại Việt Nam và phân tích đầy đủ đặc điểm sinh học phân tử nhằm xác định vị trí phân loại, chẩn đoán, phả hệ và di truyền phân tử, thực hiện dịch tễ học phân tử so sánh với các chủng của Việt Nam và của thế giới, từ đó có dữ liệu/số liệu công bố ít nhất 02 bài báo quốc tế thuộc SCI/SCIE.

TS. Lê Thị Kim Xuyến cùng các cộng sự tại Viện Công nghệ Sinh học đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm hệ gen và xác định genotype (genotyping) một số virus RNA gây bệnh truyền nhiễm ở gia cầm tại Việt Nam” trong khoảng thời gian từ năm 2014 đến năm 2019.

Một số kết quả nổi bật của đề tài:

Kết quả Nội dung 1: Thu mẫu và bước đầu giám định mẫu nghiên cứu

- Đã thu thập được: + 26 mẫu virus Gumboro từ đàn bệnh để phân tích xác định virus cường độc và 02 mẫu vắc xin Gumboro (2512 và Blue) cho công bố quốc tế, trong số gần 50 mẫu thu thập, một số mẫu cho công bố quốc gia; + 08 mẫu virus Newcastle cường độc và 03 mẫu vắc xin đang sử dụng đủ điều kiện cho công bố quốc tế, trong số trên 20 mẫu thu thập. Một số mẫu dùng cho công bố quốc gia; + 08 mẫu virus viêm phế quản truyền nhiễm từ đàn bệnh trong số 15 mẫu thu thập được công bố.

- Sử dụng bộ Kit tách RNA tổng số RNeasy minikit của QIAgen, theo hướng dẫn của nhà sản xuất, đã tách RNA tổng số các mẫu virus thu thập được, theo từng nội dung nghiên cứu. RNA tổng số sau đó dùng làm khuôn để thực hiện phản ứng RTPCR, hoặc được chuyển đổi thành DNA bổ sung (cDNA) sử dụng mồi xác xuất hecxamer của hãng Fermentas theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm cDNA được dùng làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại gen đích phục vụ giải trình tự và phân tích đặc điểm chuỗi gen, gồm 3 nội dung nghiên cứu virus: Virus Gumboro (IBDV) ở gà; virus Newcastle (NDV) ở gà; virus Viêm phế quản truyền nhiễm (IBV) ở gà.

Kết quả Nội dung 2: Nghiên cứu gen học/định type và dịch tễ phân tử virus Gumboro (IBDV)

Các sản phẩm RT-PCR/PCR được tinh sạch bằng bộ sinh phẩm QIAquick PCR purification Kit (QIAGEN)/AccuPrep Gel Purification Kit (BiONEER), sau đó giải trình tự trực tiếp bằng mồi xuôi và mồi ngược (đối với các sản phẩm PCR ngắn); hoặc bằng cách lao mồi (primer-walking) với các sản phẩm PCR dài để thu được các chuối nucleotide thô. Các chuỗi thô được xử lý bằng các phần mềm tin-sinh học, Chromas 2.6.6, Australia; và GENEDOC 2.7, để có được chuỗi cuối cùng. Các chuỗi cuối cùng thu nhận được được sắp xếp phân tích với các chủng IBDV trong và ngoài nước.

Xác định được kích thước từng gen: VP2 (1356 bp); phân đoạn A (3039 bp); phân đoạn B (2829 bp), đã xác định trật tự sắp xếp gen bằng cách so sánh với các dữ liệu hiện có của các gen/hệ gen trong Ngân hàng gen.

Kết quả Nội dung 3: Nghiên cứu gen học/định type và dịch tễ phân tử virus Newcastle (NDV)

RNA tổng số được tách chiết từ các mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp QIAam Viral Mini Kit 50 (QIAGEN-Đức). RNA tổng số sau đó được chuyển thành cDNA sử dụng mồi xác suất Hexamer (Fermentas-Mỹ). Các đoạn mồi để khuếch đại gene F được thiết kế dựa trên trình tự được bảo tồn của bộ gen NDV có sẵn, bao gồm, mồi xuôi UFUSF: 5’-TTA RAA AWA ACA CGG GTA GAAG-3. ... được sử dụng để giải trình tự. Phản ứng PCR với chu trình nhiệt: 1 chu kỳ ở 94oC trong 5 phút, 35 chu kỳ [94oC trong 1 phút, 52oC trong 30 giây; 72oC trong 3 phút], và 1 chu kỳ ở 72oC trong 10 phút. Phản ứng PCR được thực hiện trên máy MJ PCT-100 (MJ Research, USA). Sản phẩm PCR được điện di trên thạch agarose 1%, nhuộm bằng ethidium bromide và quan sát trên máy soi gel Wealtech (Mỹ). Sản phẩm sau khi được tinh sạch bằng bộ sinh phẩm QIAquick PCR Purification kit (QIAGEN-Đức) được gửi đọc trình tự trực tiếp. Sau khi giải trình tự, các chuỗi nucleotide thô được xử lý bằng các phần mềm của máy tính Macintosh bao gồm chương trình SeqEd1.03, so sánh bằng AsemblyLIGNv1.9c và hệ chương trình MacVector 8.2 (Accelrys Inc).

Tám chủng virus gây bệnh Newcastle ở Việt Nam được phân lập từ 2008 đến 2015 và 3 chủng vắc xin hình thành kiểu gen (genotype) dựa trên trình tự gen F đầy đủ của chúng và so với 80 chủng tham chiếu đại diện cho tất cả 18 kiểu gen trên thế giới. Ba chủng tạo thành một kiểu gen riêng biệt XIId (subgenotype XIId), được xác định lần đầu tiên ở Việt Nam, khác với kiểu gen XIIb của Trung Quốc và XIIa của Peru, trong genotype XII. Những chủng khác phân thành bốn trong kiểu gen VIId và VIIh; hai trong kiểu gen genotype I; và hai trong kiểu gen genotype II.

Tính toán khoảng cách tiến hóa đã xác nhận kiểu gen XIId của Việt Nam được phân biệt với XIIa và XIIb bằng 0,062 - 0,070; và từ các kiểu gen khác bằng 0,089 - 0.245. Dữ liệu này đã được chứng minh rằng kiểu gen XIId xuất hiện ở Việt Nam cho thấy sự đa dạng di truyền đáng kể trong lưu hành virus Newcastle, do đó nhấn mạnh sự cần thiết phải thực hiện vắc xin có kháng nguyên tương ứng trong quá trình tiêm chủng vắc xin chống lại NDV.

Như vậy, phân tích phả hệ dựa vào chuỗi gen kháng nguyên F cho phép xác định được chủng nghiên cứu thuộc genotype nào trong hệ thống phân loại của NDV. Trong đó 11 chủng của Việt Nam nằm ở 4 genotype khác nhau là genotype I; II; VII và XII (XIId). Các chủng của genotype VII có độc lực rất cao, gây ra đại dịch gần đây ở vùng Viễn Đông, Châu Âu và Nam Phi. Việc nghiên cứu định type của các chủng NDV phân lập tại Việt Nam trong các ổ dịch tự nhiên, cũng như xác định genotype và mối quan hệ kháng nguyên-miễn dịch của các chủng virus vắc xin đang sử dụng, góp phần tạo nên dữ liệu sinh học phân loại của virus Newcastle cường độc đang lưu hành và sử dụng vắc xin tại Việt Nam.

Có thể tìm đọc báo cáo kết quả nghiên cứu (mã số 16256/2019) tại Cục Thông tin Khoa học và Công nghệ Quốc gia.

N.P.D (NASATI)