Nghiên cứu tạo kit tách chiết ADN và ARN từ các tiêu bản cố định mẫu mô ung thư
Cập nhật vào: Thứ ba - 19/03/2019 10:35
Cỡ chữ
Sử dụng nến và parafin trong bảo quản lâu dài các mô ung thư là một phương pháp hiệu quả giúp cung cấp nguồn mẫu dự trữ dồi dào và có chất lượng ổn định cho nghiên cứu, cũng như các xét nghiệm thường quy trong bệnh viện và chẩn đoán dịch tễ học phân tử trên quy mô lớn.

Trong đó tách chiết ADN và ARN từ các tiêu bản mô ung thư cố định bằng formalin trong thể vùi parafin (formalin-fixed, paraffin-embedded tissue, gọi tắt là mô ung thư FFPE) là bước đi đầu tiên giúp phát hiện các dấu ấn phân tử liên quan đến ung thư sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử như: giải trình tự gen, Real time PCR... nhằm xác định chính xác các đột biến gen hay định lượng mức độ biểu hiện của gen chỉ thị ung thư giúp các bác sỹ lâm sàng tiên lượng được bệnh, chẩn đoán chính xác hơn và chỉ định điều trị thuốc hướng đích hiệu quả (Ahmad-Neiad et al., 2015; Gilbert et al., 2007). Hiện nay việc tách chiết ADN và ARN từ các tiêu bản mô ung thư FFPE còn gặp nhiều khó khăn, hàm lượng ADN/ARN thấp và ADN/ARN bị đứt gãy sau khi tách chiết, gây trở ngại cho các kỹ thuật chẩn đoán sinh học phân tử khi sử dụng ADN/ARN tách chiết làm khuôn của phản ứng (Masuda et al., 1999; Macabeo-Ong et al., 2002; Shi el al., 2004; McSherry et al., 2007). Dựa trên nền tảng nguyên lý của phương pháp Boom (Boom et al., 1990), nhiều công ty sinh phẩm trên thế giới đã tạo ra các bộ kit tách chiết ADN/ARN từ mẫu mô ung thư FFPE dựa trên công nghệ cột màng silica. Một số bộ sinh phẩm hiện đang sử dụng phổ biến tại các khoa xét nghiệm bệnh viện có thể kể đến là ReliaPrep™ FFPE DNA Miniprep System, ReliaPrep™ FFPE Total RNA Miniprep System (Promega), Invisorb® Spin Tissue Mini Kit (Stratect)… Tuy vậy, hạn chế của phương pháp này là thời gian thực nghiệm dài với số lượng mẫu lớn, không tự động hóa được quy trình tinh sạch nên có khả năng nhiễm chéo cao giữa các mẫu trên cùng 1 lần thao tác. Để khắc phục nhược điểm này, các công ty sinh phẩm hóa chất phát triển các bộ kit sử dụng hạt oxit sắt từ tính bọc silica (Fe3O4/SiO2) kích thước micromet. Các phân tử nucleic acid sau khi liên kết với hạt micro từ bọc silica sẽ được giữ lại và tách riêng ra khỏi protein, các hợp chất khác nhờ nam châm. Nucleic acid sẽ thu được dưới dạng tinh sạch khi được tách ra khỏi hạt micro từ bọc silica bằng dung dịch đệm có nồng độ muối thấp hoặc bằng nước cất (Stephane et al., 2004). Một số kit thương mại sử dụng hạt micro từ tính bọc silica như MagMAX FFPE DNA isolation kit (Thermo Scientific, Mỹ), Maxwell 16 FFPE Tissue LEV DNA Purification kit (Promega, Mỹ), SaMag™ FFPE DNA Extraction Kit (Sacace, Ý)… với quy trình đơn giản và thời gian tách chiết rút ngắn còn khoảng 3 tiếng cho 24-96 mẫu tùy vào số giếng trên giá nam châm của hệ thống tách chiết tự động.
Ở Việt Nam hiện nay chưa có công ty nào sản xuất bộ kit tách chiết ADN và ARN từ mô ung thư FFPE. Vì vậy, các khoa xét nghiệm thuộc các bệnh viện tuyến Trung ương vẫn phải sử dụng các kit nhập ngoại với giá thành cao (100-150 nghìn đồng/phản ứng) cho các bệnh nhân tự nguyện chi trả xét nghiệm. Do vậy, việc chủ động tạo ra các bộ kit này là rất cần thiết để chuyển giao công nghệ, sản xuất và ứng dụng các bộ kit có chất lượng tương đương với bộ kit ngoại nhập, giá thành cạnh tranh, phục vụ việc chẩn đoán tại các bệnh viện.
Nhằm mục tiêu nghiên cứu tạo bộ kit tách chiết ADN và ARN từ các tiêu bản cố định mẫu mô ung thư trong thể vùi parafin (gọi tắt là ADN và ARN từ mô ung thư FFPE) bằng công nghệ hạt nano từ bọc silica với các ưu điểm: hiệu suất tách chiết cao, thời gian tách chiết ngắn, giá thành giảm khoảng 3 lần so với kit nhập ngoại, nhóm nghiên cứu do PGS.TS. Nguyễn Thị Vân Anh, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đứng đầu đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tạo kit tách chiết ADN và ARN từ các tiêu bản cố định mẫu mô ung thư”.
Sau một thời gian triển khai, nhóm nghiên cứu đã thu được các kết quả như sau:
Tách chiết ADN và ARN từ các tiêu bản cố định bằng formalin trong thể vùi parafin (mô ung thư FFPE) là bước quan trọng giúp phát hiện các dấu ấn phân tử liên quan đến ung thư. Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu đã chế tạo được các bộ kit tách chiết ADN và ARN từ mô ung thư FFPE sử dụng hạt nano từ tính bọc silica và các bộ đệm phù hợp và đánh giá chất lượng các bộ kit tạo thành.
Cụ thể, đã xây dựng được quy trình sản xuất bộ kit tách chiết ADN và ARN từ mô ung thư FFPE với tên thương mại là MagPure FFPE DNA nano kit và MagPure FFPE RNA nano kit dựa trên các thành phần chính được tối ưu: (i) Hạt Fe3O4@ SiO2 Magsi nano ký hiệu M1 (14,7 nm Fe3O4@SiO2, từ độ bão hòa 50,2 emu/g) để tách chiết ADN và ký hiệu M3 (34,9 nm Fe3O4@SiO2, từ độ bão hòa 10,3 emu/g ) để tách chiết ARN; (ii) bộ đệm ly giải và gắn ADN lên hạt ký hiệu LB2-01 + BB2-01 và bộ đệm ly giải và gắn ARN lên hạt ký hiệu LB1-02 + BB3-02.
MagPure FFPE DNA nano kit được đánh giá có hiệu quả và thời gian tách chiết tương đương với kit nhập ngoại có uy tín, và thậm chí lượng ADN tách chiết cao hơn 2-15 lần trên một số mẫu thử nghiệm. Trong đó hàm lượng ADN đạt 2-40 µg/10 mg mô, nồng độ ADN 20-400 ng/µl, độ tinh sạch 1,8-2,2.
MagPure FFPE RNA nano kit được đánh giá có hiệu suất thu hồi ARN kém 2-3 lần so với kit Promega, tuy nhiên độ tinh sạch, chất lượng và thời gian tách chiết là tương đương. Hàm lượng ARN tách từ 10 mg mô ung thư FFPE là 2-10 µg, nồng độ ARN 20-100 ng/µl, độ tinh sạch 1,9-2,1.
ADN/ARN tách chiết bởi các bộ kit MagPure đã được thử nghiệm tại 02 đơn vị y tế và đã được chứng minh có khả năng sử dụng làm khuôn cho các phản ứng PCR kết hợp giải trình tự gen, real time PCR trong phát hiện các đột biến gen chỉ thị ung thư và các virus gây bệnh liên quan tới ung thư đại tràng, mũi họng, và tuyến giáp.
Kết quả thử nghiệm cũng cho thấy sự tương đồng cao với các bộ kit đã thương mại. 02 bộ MagPure kit có giá thành thấp hợp 1/3-1/4 lần so với kit thương mại, và đã được chuyển giao công nghệ cho công ty ANABIO R&D để sản xuất và thương mại hóa trong thời gian tới.
Có thể tìm đọc toàn văn Báo cáo kết quả nghiên cứu của Đề tài (Mã số 14711/2018) tại Cục Thông tin Khoa học và Công nghệ Quốc gia.
P.T.T (NASATI)