Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài đặc hữu và chọn lọc thuộc ba chi Hedyotis, Allophylus và Chirita của vịnh Hạ long nhằm đóng góp vào kho tàng hóa học các hợp chất thiên nhiên của Việt nam nói riêng và thế giới nói chung, góp phần bảo tồn nguồn gien đặc hữu quí hiếm của thực vật Hạ long, tạo cơ sở khoa học để có thể đề xuất khả năng ứng dụng và khai thác các loài đã nghiên cứu phục vụ ngành y, dược, thực phẩm chức năng, phát triển kinh tế xã hội.

Nhóm nghiên cứu do bà Nguyễn Thị Hoàng Anh, Viện Hóa học, Viện Hàn Lâm KH và CNVN đứng đầu đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học một số loài đặc hữu và chọn lọc của Vịnh Hạ long thuộc 3 chi Hedyotis, Allophylus và Chirita”.

Phạm vi nghiên cứu bao gồm thu thập mẫu nghiên cứu và xác định tên khoa học của 8 - 12 loài đặc hữu, chọn lọc, chưa được nghiên cứu hoặc mới được nghiên cứu rất ít thuộc ba chi Hedyotis, Allophylus và Chirita của Vịnh Hạ long ở các thời điểm khác nhau. 
- Xử lý mẫu và chiết mẫu với các dung môi có độ phân cực tăng dần để thu được các cặn chiết. 
- Thử hoạt tính sinh học (chống oxy hóa, độc tế bào, kháng khuẩn...) của các cặn chiết thu được. 
- Phân lập các chất sạch từ các cặn chiết có hoạt tính bằng phương pháp sắc ký cột với các chất hấp phụ khác nhau như silica gel, RP-18, sephadex LH-20, trao đổi ion; phương pháp kết tinh phân đoạn... 
- Xác định cấu trúc hóa học của các chất sạch phân lập được bằng các phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (IR), khối khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D (1H, 13C-NMR) và 2D (1H-1H-COSY, HMQC, HMBC, NOESY). 
- Thử hoạt tính sinh học của các chất sạch phân lập được. 
- Dựa vào kết quả nghiên cứu hoạt tính, tiến hành một số chuyển hóa hóa học để tìm kiếm các dẫn xuất có hoạt tính tốt hơn tạo cơ sở khoa học cho việc phát triển tiếp theo thành sản phẩm.
 - Đề xuất khả năng ứng dụng và khai thác các loài đã nghiên cứu phục vụ ngành y, dược, thực phẩm chức năng...

Sau một thời gian triển khai, nhóm nghiên cứu thu được các kết quả như sau:  
1. Thu thập 8 mẫu thực vật thuộc 3 Chi Hedyotis, Allophylus và Chirita mọc ở vùng Vịnh Hạ long, ven biển Thừa thiên Huế và vườn quốc gia Vũ Quang, Hà Tĩnh bao gồm: Cày rita drake (Chirita drakei Burtt), Cày rita Hạ long (Chirita halongensis Kiew & T.H.Nguyen), Cày ri ta móc (Chirita hamosa R. Br), An điền lá thông (Hedyotis pinifolia Wall. Ex G. Don), An điền hoa rộng (Hedyotis ampliflora Hance), An điền đơn (Hedyotis symplicissima (Lour.) Merr.), An điền đâu (Hedyotis capitellata var. mollis Pierre ex Pitard), Ngoại mộc tái (Allophylus livescens Gagnep). Tên khoa học của các loài trên được TS. Nguyễn Phương Anh, Đỗ Xuân Cẩm và Đỗ Ngọc Đại xác định.
2. Tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của 5 loài trong số các loài đã thu hái mẫu nêu trên. Dựa vào kết quả trên sắc ký bản mỏng phân tích, các mẫu thực vật của 5 loài trong số thu hái về đã được tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Kết quả cụ thể về từng cây được trình bày sau đây: 
(1) Cây Ngoại mộc tái (Allophylus livescens Gagnep): Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên về hóa học và hoạt tính sinh học của cây này. Mẫu cây Ngoại mộc tái được thu hái tại vùng Vịnh Hạ long vào tháng10 năm 2013. Tên cây được TS. Trần Thị Phương Anh, Bảo tàng thiên nhiên Việt nam, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ VN xác định. 
 + Kết quả về hóa học: Từ các cặn chiết của lá và cành cây Ngoại mộc tái 5 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc. Chúng là: 1,6,10,14-phytatetraene-3-ol, catechin, stigmasterol, beta-sitosterol and betasitosterol glucoside.
+ Kết quả về hoạt tính sinh học: Chất 1,6,10,14-phytatetraene-3-ol thể hiện kết quả âm tính khi thử hoạt tính gây độc tế bào với 5 dòng tế bào ung thư ở người (KB, Hep G2, LU-1, MCF-7, SK). Các kết quả này đã được công bố trên bài báo ở Tạp chí Hóa học. 
(2) Cây Cày rita drake (Chirita drakei Burtt) Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Cày rita drake ở Việt nam cũng như trên thế giới. 
+ Kết quả về hóa học: Từ các cặn chiết n-hexan, ethyl acetat và n-buthanol phần trên mặt đất cây C. drakei, 14 hợp chất đã được phân lập. Cấu trúc của chúng được xác định là hai phenylethanoid glycoside mới (chiridrakoside A, chiridrakoside B) và 12 hợp chất đã biết bao gồm năm phenylethanoid glycoside [cusianoside B, desrhamnosyl isoacteoside, chiritoside C, brachyanin D, 2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethyl-beta-D-glucopyranoside], hai lignans [(+)lariciresinol, (+)-isolariciresinol], một phenyl propanoid (epoxyconiferyl alcohol), một anthraquinone (digiferruginol), một dẫn xuất furan (cannabiside B) và hai triterpene (24-methylenelanost-8-en-3beta-ol, 3anpha,24-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid) bằng các phương pháp phổ khối (MS), cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo. Trong đó, ngoại trừ desrhamnosyl isoacteoside, chiritoside C, digiferruginol các chất khác đều được phân lập lần đầu tiên từ chi Chirita. 
+ Kết quả thử hoạt tính gây độc trên 4 dòng tế bào ung thư ở người (KB, HepG2, Lu, MCF7) của 14 chất phân lập được cho thấy chất epoxyconiferyl alcohol thể hiện khả năng ức chế tốt nhất với cả 4 dòng tế bào thử nghiệm với giá trị IC50 từ 46 đến 128 µM). Từ các kết quả thu được về cây C. drakei, nhóm nghiên cứu đã công bố được 1 bài báo trên tạp chí Natural Product Communications và 2 bài trên tạp chí Hóa học. 
(3) Cây Cày ri ta Hạ long (Chirita halongensis Kiew & T.H. Nguyen) Mẫu cây C. halongensis được thu hái tại vùng Vịnh Hạ long vào tháng10 năm 2013. Tên cây được TS. Trần Thị Phương Anh, Bảo tàng thiên nhiên Việt nam, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ VN xác định. Đây là nghiên cứu đầu tiên về hóa học của cây này ở Việt nam và thế giơi. Từ các cặn chiết n-hexan, ethyl acetat và n-buthanol toàn bộ cây C. halongensis, 9 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc. Chúng bao gồm 3anpha, 24-dihydroxy-urs-12-en-28-oic acid, 7-hydroxytecto quinone, ursolic acid, oleanolic acid, acteoside, isoacteoside, decaffeoylacteoside, beta-Hydroxy acteoside, 2-(3,4dihydroxyphenyl)-ethyl-beta-D-glucopyranoside Trong đó 5 chất (acteoside, isoacteoside, decaffeoylacteoside, beta-hydroxy acteoside, 7-hydroxytecto quinone) lần đầu tiên được phân lập từ chi Chirita. Bài báo về kết quả nghiên cứu loài C. halongensis đã gửi đăng trên Tạp chí Hóa học.
(4) Cây An điền lá thông (Hedyotis pinifolia Wall. Ex G. Don), hiện nay được gọi là Odenlandia pinifolia Mẫu cây được thu hái tại vùng ven biển ở Huế vào tháng 10 năm 2014, tên cây do TS. Đỗ Xuân Cẩm, Đại học Nông lâm Huế xác định.
+ Kết quả về hóa học: Từ các cặn chiết n-hexan, ethyl acetat và n-buthanol đã phân lập và xác định cấu trúc của 13 chất. Chúng gồm 3 hợp chất anthraquinone: 2-methyl-1,4,6-trihydroxy-anthraquinone, 2-hydroxy-1methoxy-anthraquinone, 1,6-dihydroxy-2-methyl-anthraquinone; 2 triterpen: oleanolic acid, ursolic acid; 4 iridoid glucoside: deacetyl asperuloside, scandoside methyl ester, asperuloside, asperulosidic acid; 3 flavonoid glycoside: afzelin, isoramnetina-3-O-beta-robinobioside, rutin và 1 carotenoid: lutein. 
+ Kết quả về hoạt tính sinh học: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh trên các chủng Gram(+): Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Lactobacillus fermentum; Gram(-): Salmonella enterica, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và nấm: Candida albican của các chất asperulosidic acid, deacetyl asperuloside, scandoside methyl ester cho thấy chúng đều không có khả năng ức chế các chủng thử nghiệm. Cao chiết n-butanol và 7 hợp chất phân lập từ cây An điền lá thông được tiến hành thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào kết quả cho thấy: 
+ Hợp chất 2-hydroxy-1-methoxy-anthraquinone thể hiện hoạt tính gây độc tế bào khá tốt trên 4 dòng tế bào ung thư KB, HepG2, LU-1 và MCF7 với IC50 60,47-786,93 µM. Đáng chú ý là hợp chất này thể hiện hoạt tính mạnh nhất trên dòng ung thư KB với IC50 = 60,47 µM. 
+ Hợp chất mới 2-methyl-1,4,6-trihydroxy-anthraquinone và asperuloside chỉ thể hiện khả năng ức chế yếu trên dòng tế bào ung thư biểu mô KB với IC50 lần lượt là 335,33 và 288,57±1,84 µM. 
+ Cao chiết n-butanol thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh hơn các hợp chất phân lập từ cao này (Deacetyl asperuloside, scandoside methyl ester, isorhamnetin-3-O-β-rutinoside, rutin) trên dòng tế bào K562 với giá trị IC50 là 188,08 ± 19,22 µg/mL. 
+ Hợp chất isorhamnetin-3-O-β-rutinoside có hoạt tính gây độc tế bào mạnh hơn các hợp chất khác với giá trị IC50 là 394,68±25,12 µM. 
Dựa vào kết quả trên, cao chiết n-butanol và 5 hợp chất phân lập từ cao chiết này (asperuloside, deacetyl asperuloside, scandoside methyl ester, isorhamnetin-3-O-β-rutinoside, rutin) được thử hoạt tính cảm ứng apoptosis để hiểu rõ hơn về cơ chế chống tăng sinh tế bào. Kết quả về hoạt tính cảm ứng apoptosis trên dòng tế bào Hela, HepG2 của các mẫu thí nghiệm thông qua phương pháp nhuộm Hoechst 33342 cho thấy: 
+ Cao chiết n-butanol và isorhamnetin-3-O-β-rutinoside, rutin có tỉ lệ tế bào có hiện tượng apoptosis từ 10,25% trở lên ở nồng độ mẫu thử 200 µg/ml, cao hơn so với đối chứng âm (4,67%) (p<0,05) và mẫu isorhamnetin-3O-β-rutinoside, rutin có khả năng gây apoptosis với tỉ lệ tế bào có hiện tượng apoptosis lần lượt là 11,00 % và 11,6 % ở nồng độ mẫu thử 300 µg/ml, cao hơn so với đối chứng âm (2,4%) (p<0,01).
 + Tỉ lệ tế bào apoptosis ở giếng thử mẫu asperuloside, deacetyl asperuloside và scandoside methyl ester lần lượt là 6,5%, 3,8% và 5,4 % cao hơn so với đối chứng tuy nhiên sự sai khác này không có ý nghĩa thống kê so với đối chứng âm (p>0,05). 
- Nhân bị phân đoạn thành mảnh nhỏ và đứt gẫy DNA là hiện tượng đặc trưng của quá trình apoptosis. Vì vậy, khả năng gây apoptosis của hoạt chất được xác định thông qua phương pháp chạy điện di trên gel agarose. Kết quả điện di trên gel agarose cho thấy không có hiện tượng DNA bị đứt gãy rõ khi ủ tế bào với mẫu thí nghiệm. 
- Xác định hoạt tính caspase 3 của mẫu cao chiết n-butanol và caspase 3 của mẫu isorhamnetin-3-O-βrutinoside và rutin 
+ Xác định hoạt tính caspase 3 của cao chiết n-butanol Tế bào sau khi được xử lý với mẫu sẽ được thu lại và dịch ly giải tế bào sẽ được sử dụng KIT để xác định caspase 3. Kết quả cho thấy mẫu cao chiết n-butanol thể hiện hoạt tính kích thích caspase 3 ở những nồng độ trên 100 μg/mL.
+ Xác định hoạt tính caspase 3 của mẫu isorhamnetin-3-O-β-rutinoside và rutin - Do 2 mẫu isorhamnetin-3-O-β-rutinoside và rutin thể hiện khả năng kích hoạt apoptosis, gây cô đặc nhân tế bào (trong thí nghiệm nhuộm Hoechst 33342) so với đối chứng nên chúng tôi tiến hành xác định khả năng kích hoạt caspase 3 của 2 hợp chất này. Kết quả cho thấy hợp chất isorhamnetin-3-O-β-rutinoside thể hiện hoạt tính kích thích caspase 3 ở các nồng độ 200 và 300 μg/mL. Tuy nhiên, hợp chất rutin không thể hiện khả năng kích hoạt caspase 3.
Như vậy, cao chiết n-butanol, isorhamnetin-3-O-β-rutinoside, rutin thể hiện khả năng cảm ứng apoptosis thông qua nhuộm Hoechst 33342. Cao chiết n-butanol có khả kích thích caspase 3 ở nồng độ lớn hơn 100 μg/mL và isorhamnetin-3-O-β-rutinoside cảm ứng caspase 3 ở mức có ý nghĩa thống kê. Kết quả nghiên cứu về cây này đã được công bố trên tạp chí Natural Products Research và 2 bài đã gửi đăng tại tạp chí Vietnam Journal of Science and Technology 
(5) Cây An điền hoa rộng (Hedyotis ampliflora Hance) Mẫu cây được thu hái tại vườn quốc gia Vũ quang, tỉnh Hà tĩnh vào tháng 7 năm 2015, tên cây do TS. Đỗ Ngọc Đại, Đại học Vinh xác định. Từ các cặn chiết n-hexan, ethyl acetat và n-buthanol đã phân lập và xác định cấu trúc của 8 chất, đó là cassipourol, 24-methylene-cholest-7-en-3beta-ol, oleanolic acid, ursolic acid, asperuloside, mussaenoside, asperulosidic acid, scandoside. Trong đó có 3 chất: mussaenoside, cassipourol và 24-methylene-cholest-7-en-3beta-ol lần đầu tiên được tìm thấy ở chi Hedyotis. Bài báo về kết quả nghiên cứu cây An điền hoa rộng đã được chấp nhận đăng trên tạp chí Chemistry of Natural Compound. 

Có thể tìm đọc toàn văn Báo cáo kết quả nghiên cứu của Đề tài (Mã số 14792/2018) tại Cục Thông tin Khoa học và Công nghệ Quốc gia.
P.T.T (NASATI)