Cam, quýt, chanh, bưởi là một trong nhiều loại cây ăn quả chủ lực của nước ta, là loại cây có giá trị dinh dưỡng cao... Theo Cục Trồng trọt diện tích, sản lượng cây có múi liên tục tăng trong những năm gần đây với tốc độ tăng trưởng cao, trong đó tại phía Bắc trong 10 năm (từ 2009 đến 2019) tốc độ tăng trưởng cây có múi bình quân đạt 10% về diện tích (7,3 nghìn ha/năm); 12,5% về sản lượng (69,4 nghìn tấn/năm). Tính đến hết năm 2019, tổng diện tích cây có múi cả nước đạt 256,86 nghìn ha chiếm 24,07% tổng diện tích cây ăn quả. Tổng giá trị xuất khẩu quả có múi từ năm 2015 liên tục tăng, từ 16,5 triệu USD lên hơn 71,4 triệu USD năm 2017 và 47,5 triệu USD năm 2019; trong đó sản phẩm chủ yếu là chanh, tiếp đến là bưởi.

Mặc dù, diện tích và sản lượng cây ăn quả có múi đang tăng nhanh, nhưng còn gặp rất nhiều khó khăn do dịch bệnh và chất lượng giống. Trong đó, hai bệnh hại cây có múi đặc biệt nghiệm trọng là bệnh vàng lụi Tristeza (do virus) và vàng lá greening (do vi khuẩn). Bệnh Tristeza đã từng tiêu diệt hàng chục triệu cây giống mỗi năm ở Châu Âu và Châu Mỹ trongnhững thập kỷ 60-70 vừa qua. Đến nay, nhân loại lại đối mặt với loại bệnh dịch nghiêm trọng là bệnh Vàng lá greening hay còn có tên là bệnh Huanglongbing (HLB) hoặc là bệnh Greening. Sức tàn phá của bệnh greening rất lớn, nhiều vườn có 100% số cây bị bệnh ngay từ trong vườn ươm. Các vùng trồng cam lớn đang có nguy cơ bị tàn lụi. Ví dụ, vùng cam Sành Bố Hạ được trồng rộng rãi ở Bắc Giang đã bị xoá sổ do bệnh vàng lá greening (Vũ Mạnh Hải et al., 2000).

Hiện nay, các phương pháp phòng trừ hai dịch bệnh trên chủ yếu dựa trên bốn chiến lược sau : (i) sử dụng vật liệu giống sạch bệnh, (ii) loại bỏ sớm cây bệnh, (iii) phòng chống vector và (iv) tạo giống kháng bệnh. Tất cả các chiến lược trên đều yêu cầu một kỹ thuật chẩn đoán chính xác. Chẩn đoán bệnh vàng lá Greening dựa vào triệu chứng rất khó vì bệnh biểu hiện triệu chứng không đặc trưng. Nhiều tác nhân như virus tàn lụi (CTV) cũng gây triệu chứng tương tự. Xác định trực tiếp vi khuẩn trong cây bằng kính hiển vi điện tử hoặc PCR rất phức tạp và đắt, đòi hỏi trang thiết bị đặc biệt. Chính vì vậy, việc phát triển các KIT chẩn đoán bệnh chính xác, nhanh, dễ sử dụng, dựa trên kháng thể đặc hiệu, như ELISA, que thử nhanh, là yêu cầu cấp thiết.

Xuất phát từ thực tiễn đó, TS. Nguyễn Thị Bích Ngọc và nhóm nghiên cứu tại Viện Bảo vệ thực vật đã thực hiện “Nghiên cứu sản xuất KIT chẩn đoán bệnh vàng lá Greening và bệnh tàn lụi (CTV) trên cây có múi” với mục tiêu: Sản xuất thành công KIT chẩn đoán chính xác bệnh vàng lá greening và bệnh tàn lụi (CTV) và ứng dụng có hiệu quả trong chẩn đoán nhằm tạo nguồn cây sạch bệnh.

Sản xuất cam quýt là một trong những hoạt động kinh tế nông nghiệp quan trọng nhất trên thế giới. Theo Tổ chức Nông lương (FAO 2014), hàng năm trên thế giới có khoảng 122 triệu tấn trái cây có múi được sản xuất, tương ứng với khoảng 17 tỷ đô la Mỹ từ việc bán nước ép và trái cây tươi. Gần đây, thiệt hại kinh tế trong sản xuất cam quýt xảy ra trong nhiều năm do bệnh như bệnh vàng lá greening đang trở thành một trong những thách thức lớn nhất đối với người trồng cây có múi trên toàn thế giới (Cevallos-Cevallos et al. 2012), vì làm giảm năng suất và chất lượng trái và làm suy yếu nghiêm trọng sức sống của cây. Bệnh vàng lá Greening được biết là do vi khuẩn gram âm có tên là “Candidatus liberibacter” sống trong mạch dẫn của cây gây ra. Loài gây hại ở Châu Phi là Candiatus Liberibacter africanus, ở Châu Á (gồm cả Việt Nam) là Candidatus Liberibacter asiaticus. Vi khuẩn gây xáo trộn sinh lý, làm tắc nghẽn quá trình vận chuyển dinh dưỡng làm ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây. Cây bị bệnh vàng lá greening sinh trưởng rất còi cọc; bộ lá, đặc biệt là lá non, bị biến vàng; quả nhỏ, lệch, bị biến vàng phần cuống trước khi chín, không có giá trị sử dụng.

Bệnh phổ biến chủ yếu tại các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới. Hầu hất các vùng trồng các loài cây cam chanh tại châu Á đều nhiễm phải, trừ Nhật Bản. Bệnh được ghi nhận ở Trung Quốc vào 1943, được báo cáo lần đầu tiên ở Nam Phi vào năm 1947 và được xác định ở Đài Loan vào năm 1951. Bệnh trở nên phổ biến ở nhiều vùng sản xuất cây ăn quả có múi ở các nước Châu Á và Châu Phi từ 1960 (Su, 2003). Bệnh đã và đang lan rộng trên 50 quốc gia và đe doạ nghiêm trọng đến nguồn gen cây ăn quả có múi ở các nước châu Phi, châu Á và châu Mỹ (Bové, 2006). Các nước sản xuất cam quýt lớn nhất thế giới hiện nay là Brazil, Trung Quốc, Ấn Độ, Mexico và Hoa Kỳ đang bị đe dọa đặc biệt nghiêm trọng bởi bệnh vàng lá greening (De Brasil Cardinali et al. 2012; FAOSTAT 2009). Ở Philippine, bệnh là nguyên nhân chính làm sản lượng cây ăn quả có múi ở đây giảm tới 60% trong những năm từ 1961 đến 1970 (Chang, 1995). Theo Timmer et al. (2003) bệnh Greening cũng đã phá huỷ khoảng 60 triệu cây có múi trên thế giới.

Sau thời gian nghiên cứu, đề tài đã thu được những kết quả như sau:

- Đề tài đã đánh giá 330 mẫu bệnh vàng lá thu thập tại 7 tỉnh, trong đó tỷ lệ nhiễm bệnh greening từ 46 - 74% và xác định có 2 chủng gây bệnh greening là chủng I và II.

- Đã thiết kế vector biểu hiện và biểu hiện thành thành công 02 protein đặc hiệu kháng nguyên Omp và 02 protein đặc hiệu kháng nguyên SDE1 của vi khuẩn HLB, trong đó protein OmpA2 và SDE1a được biểu hiện ở mức độ cao. Đã xác định được điều kiện tối ưu để biểu hiện protein OmpA2 (IPTG nồng độ 1 mM, nuôi ở nhiệt độ 30ºC trong 5 giờ) và protein SDE1a (nồng độ IPTG C).°0,1mM; thời gian cảm ứng 16 giờ tại 25 C°C).

- Đã tinh sạch thành công 02 protein kháng nguyên tái tổ hợp cho vi khuẩn HLB OmpA2 và SDE1a với độ tinh sạch và độ thuần >95%. Hàm lượng protein cao nhất đạt 0,81 μg/μl với protein OmpA2 và 1,2 μg/μl với protein SDE1a.

- Đề tài đã đánh giá 350 mẫu bệnh vàng lá tại 7 tỉnh với tỷ lệ nhiễm bệnh tàn lụi (CTV) từ 22 - 52% và xác định có 01 chủng gây bệnh tàn lụi CTV (chủng nhẹ).

- Đã thiết kế vector biểu hiện và biểu hiện thành công 01 protein đặc hiệu kháng nguyên CP của virus CTV. Protein CP được biểu hiện ở mức độ cao ở nồng độ IPTG 0,5 mM, thời gian cảm ứng 5 giờ, tại 30ºC.

- Đã tinh sạch thành công protein kháng nguyên tái tổ hợp của virus CTV với độ tinh sạch và độ thuần >95%, hàm lượng protein CP cao nhất đạt 0,62 μg/μl.

- Đã tạo được 02 dòng kháng thể đơn dòng đặc hiệu, có ái lực tốt (giá trị OD cao nhất đạt 3,7) với kháng nguyên tái tổ hợp OmpA2 (sàng lọc từ thư viện 22 kháng thể lạc đà). Gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ đã tạo được 02 dòng kháng thể đa dòng OmpA2 và SDE1a đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng. Trong đó, kháng thể đa dòng SDE1a có độ đặc hiệu và hiệu giá cao (độ pha loãng kháng thể đạt 50.000 vẫn cho giá trị OD > 1 với nồng độ kháng nguyên 100 ng). Các dòng kháng thể được đã được tinh sạch và độ tinh sạch >90% (20mg/kháng thể).

- Tuy nhiên khi sử dụng kháng thể OmpA2 để kiểm tra mẫu cây nhiễm bệnh greening bằng phản ứng ELISA thì cho giá trị chẩn đoán chưa cao. Trái lại, kháng thể đa dòng SDE1a phát hiện được mầm bệnh qua protein tiết của vi khuẩn trong mạch dẫn nên có độ nhạy cao khi kiểm tra bằng ELISA. Vì vậy, kháng thể SDE1a có tiềm năng để phát triển các kỹ thuật miễn dịch và được lựa chọn phát triển KIT ELISA và que thử.

Có thể tìm đọc toàn văn Báo cáo kết quả nghiên cứu (mã số 18839/2020) tại Cục Thông tin khoa học và công nghệ quốc gia.

Đ.T.V (NASATI)