Để có thể phân lập các chủng vi khuẩn ưa mặn tại Việt Nam và khảo sát đánh giá khả năng sinh tổng hợp ectoine cũng như hydroxyectoine của các chủng phân lập được để định hướng sản xuất và ứng dụng, nhóm thực hiện đề tài của Trường Đại học sư phạm Hà Nội do PGS.TS. Đoàn Văn Thược làm chủ nhiệm đã đề xuất thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đánh giá khả năng sinh tổng hợp ectoines của một số chủng vi khuẩn ưa mặn phân lập tại Việt Nam”.

Sau một thời gian triển khai thực hiện, đề tài đã thu được một số kết quả như sau:

1. Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp ectoines

Đề tài đã phân lập và cấy tách được hơn 786 khuẩn lạc vi khuẩn trong đó có 452 khuẩn lạc từ mẫu đất rừng ngập mặn và hơn 334 khuẩn lạc từ mẫu chượp mắm tôm. Các khuẩn lạc vi khuẩn được cấy tách đã được nuôi cấy giữ giống đồng thời nuôi cấy trên các môi trường có nồng độ muối khác nhau (5, 10, 15, 20 và 25%) nhằm tuyển chọn ra các chủng có khả năng phát triển trên các nồng độ muối rộng. Khả năng phát triển của các chủng nuôi cấy giảm dần khi tăng nồng độ muối, rất nhiều chủng không mọc ở nồng độ muối 20 và 25%. Có 62 chủng có khả năng phát triển trong tất cả các nồng độ muối thử nghiệm, trong số này có 35 chủng vẫn có khả năng sinh trưởng tốt ở các nồng độ muối cao (20 và 25%) đã được lựa chọn để đánh giá khả năng sinh tổng hợp ectoine. Các chủng vi khuẩn được lựa chọn tiếp tục được nuôi cấy trên môi trường MPA hoặc LB lỏng có chứa 10% NaCl. Sau 30 giờ nuôi cấy trong máy lắc ở 30^oC với tốc độ 180 7 vòng/phút, sinh khối vi khuẩn được thu lại bằng phương pháp ly tâm và sử dụng để xác định CDW và hàm lược ectoines tích lũy trong tế bào. Trong số 35 chủng vi khuẩn được lựa chọn có đến 32 chủng có khả năng sinh tổng hợp ectoine, chỉ có 3 chủng không có khả năng sinh tổng hợp ectoine. Có 3 chủng vi khuẩn phân lập từ chượp mắm tôm có khả năng tích lũy ectoine trên 10% khối lượng tế bào khô, có 7 chủng có hàm lượng ectoine tích lũy dao động trong khoảng từ 7,5 đến 9,9%. Nhóm đề tài đã lựa chọn 10 chủng vi khuẩn có khả năng tích lũy ectoine cao đồng thời đại điện cho 3 địa điểm lấy mẫu để tiếp tục nghiên cứu đặc điểm hình thái, hóa sinh và định loại bằng di truyền phân tử.

2. Nghiên cứu hình thái và đặc điểm hóa sinh của 10 chủng vi khuẩn tuyển chọn

06 chủng vi khuẩn phân lập được từ chượp mắm tôm đều có dạng phảy khuẩn, trong khi đó 4 chủng phân lập được từ đất rừng ngập mặn có dạng trực khuẩn. Tất cả 10 chủng vi khuẩn tuyển chọn đều là vi khuẩn Gram âm, không hình thành nội bào tử. Các chủng vi khuẩn tuyển chọn đều là vi khuẩn ưa mặn trung bình (nồng độ muối tối ưu cho sinh trưởng phát triển dao động trong khoảng từ 4-10%), ưa ấm trung bình (nhiệt độ tối ưu dao động từ 30-35^oC) và ưa pH trung tính (pH dao động từ 6-7,5). Một số đăc điểm hóa sinh của 10 chủng vi khuẩn tuyển chọn đã được xác định bằng bộ kit ID32E. Các chủng vi khuẩn tuyển chọn đều có khả năng hình thành indole, sinh tổng hợp catalase, beta-glucosidase và alpha-glucosidase. 9 trên 10 chủng vi khuẩn tuyển chọn (ngoại trừ chủng VK124) đều có khả năng đồng hóa tốt các nguồn carbon phổ biến như glucose, maltose, trehalose. 10 chủng vi khuẩn tuyển chọn đều không có khả năng đồng hóa lysine và manonate, không chuyển màu phenol đỏ, không có khả năng sinh tổng hợp beta-glucoronidase. Những chủng tuyển chọn được phân lập từ mắm tôm thường có đặc điểm hóa sinh giống nhau, tương tự 3 chủng phân lập từ RNM Cần Giờ cũng có nhiều đặc điểm hóa sinh giống nhau.

3. Nghiên cứu định loại các chủng vi khuẩn tuyển chọn dựa vào đoạn trình tự gen 16S rDNA

10 chủng vi khuẩn tuyển chọn được chia thành 4 nhóm. 06 chủng tuyển chọn phân lập từ chượp mắm tôm được chia thành 2 nhóm: các chủng M7, M312, M313, M316 và M318 có quan hệ gần gũi với các loài vi khuẩn thuộc chi Salinivibrio, tỉ lệ tương đồng của đoạn trình tự gen 16S rDNA của 5 chủng này với chủng Salinivibrio costicola DSM 8285T (hiện nay được đổi tên là Salinivibrio proteolyticus DSM 8285T) là trên 99%; chủng M92 có quan hệ gần gũi với các loài thuộc chi Vibrio, tỷ lệ tương đồng của đoạn trình tự gen 16S rDNA của chủng này với chủng Vibrio alginolitycus ATCC 17749T là 99,8%. Chủng vi khuẩn VK124 được phân lập từ RNM Giao Thủy có quan hệ gần gũi với chủng Yangia pacifica JCM 12573T (tỷ lệ tương đồng 99,4%). Trình tự đoạn gen 16S rDNA của các chủng này đã được gửi vào ngân hàng gen thế giới với các mã số: MH938322 (chủng M7), MH938325 (chủng M92), MK070083 (chủng M312), MH938326 (chủng M316), MN262232 (M318). Trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng D227 và D228 tương đồng 100% và tương đồng với chủng D209 99,86%. Trình tự gen 16S rDNA của 3 chủng này đều tương đồng với chủng Halomonas organivorans CECT 5995T trên 99%. Trình tự đoạn gen 16S rDNA của 3 chủng này đã được chúng tôi gửi vào ngân hàng gen thế giới với các mã số là MH715407 (chủng D209), MH715408 (chủng D227), MH715409 (chủng D228). Ba chủng vi khuẩn này đã được lựa chọ để nghiên cứu lên men sinh tổng hợp ectoine.

4. Giải trình tự bộ gen chủng M318, nghiên cứu định loại và xác định các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp ectoines

Bộ gen của chủng M318 gồm 3.605.935 bp với hàm lượng GC khoảng 49.9%, bộ gen gồm có 2 chromosome và 2 plasmid. Bộ gen của chủng S. proteolyticus M318 có chứa 3341 gen. Trình tự bộ gen của chủng M318 gồm 2 chromosome và 2 plasmid đã được gửi vào ngân hàng gen thế giới với mã số: CP050266-CP050269

Các gen liên quan đến con đường sinh tổng hợp ectoines, vận chuyển và phân giải ectoines cũng đã được xác định trong bộ gen của chủng S. proteolyticus M318. Đây là công bố đầu tiên trên thế giới phân tích đầy đủ về các gen liên quan đến quá trình tổng hợp, vận chuyển và phân giải ectoines của một loài vi khuẩn thuộc chi Salinivibrio. Chủng vi khuẩn M318 có khả năng tích lũy hàm lượng ectoines lên đến 26,2% khối lượng tế bào khô khi nuôi trong môi trường có chứa 18% NaCl. Các kết quả nghiên cứu này đã được tổng hợp và công bố trong tạp chí Marine Biotechnology (Q1, danh mục tạp chí ISI uy tín)

5. Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp ectoines sử dụng 3 chủng vi khuẩn Halomonas ssp.

Ảnh hưởng của nguồn carbon: 3 chủng vi khuẩn tuyển chọn có khả năng sinh trưởng trên cả 5 nguồn carbon nghiên cứu, trong đó saccharose và glucose là nguồn carbon phù hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của 3 chủng vi khuẩn tuyển chọn (khối lượng sinh khối khô dao động trong khoảng từ 2,7 đến 3,5 g/L).

Ảnh hưởng của nguồn nitơ: 3 chủng vi khuẩn tuyển chọn phát triển tốt trên các nguồn nitơ hữu cơ là cao nấm men (CNM) và natri glutamate (MSG), khối lượng sinh khối khô thu được dao động trong khoảng từ 3,3 đến 4,3 g/L. Nguồn nitơ vô cơ là HNO3 cũng cho khối lượng tế bào khô tương đối tốt, CDW dao động trong khoảng từ 2,1 đến 3 g/L.

Ảnh hưởng của các nồng độ NaCl: 3 chủng vi khuẩn tuyển chọn không sinh trưởng khi môi trường nuôi cấy không có NaCl, sinh trưởng phát triển tốt nhất ở nồng độ NaCl từ 4-6%, tốc độ sinh trưởng giảm nhanh khi tăng nồng độ NaCl lên trên 9%, sinh trưởng rất yếu ở nồng độ 18% NaCl. Ngược lại với sự sinh trưởng, hàm lượng ectoine tích lũy trong tế bào tăng mạnh khi tăng nồng độ NaCl trong môi trường nuôi cấy, nồng độ ectoine tích lũy trong cực đại của các chủng D209, D227 và D228 lần lượt là 11,1, 11,2 và 14,1% khi môi trường có chứa 15% NaCl.

6. Sinh tổng hợp ectoines trong qui trình nuôi cấy 2 pha

Các kết quả nghiên cứu của phần này là tiền đề để xây dựng quy trình lên men sinh tổng hợp ectoines sử dụng các chủng vi khuẩn ưa mặn. Các kết quả nghiên cứu đã được đăng trên tạp chí Annals of Microbiology.

7. Nghiên cứu sản xuất ectoines trong nồi lên men sử dụng chủng vi khuẩn Halomonas sp. D209

Sinh khối tế bào của chủng D209 tăng mạnh trong pha I (môi trường có nồng độ 4% NaCl) và đạt 39,5 g/L sau 48 giờ nuôi cấy, hàm lượng ectoine tích lũy trong tế bào dao động không nhiều và nằm trong khoảng từ 8,5 đến 9,5%. Khi chuyển sinh khối của chủng D209 sang môi trường có nồng độ 15% NaCl, sinh khối tế bào tiếp tục tăng từ 42,3 g/L khi bắt đầu pha II lên thành 48,8 g/L sau 15 giờ nuôi cấy. Ngược lại, hàm lượng ectoine tăng khá mạnh từ 8,3% (khi bắt đầu pha II) lên thành 16,5% sau 15 giờ nuôi cấy ở pha II. Sinh khối của pha II đã được thu lại và hòa trong dung dịch 2,5% NaCl, khoảng 82% ectoine đã được giải phóng ra môi trường sau 30 phút thí nghiệm. Sinh khối tế bào được thu hồi và nuôi cấy tiếp trong môi trường có nồng độ 4% NaCl (pha I-2), sinh khối tế bào gần như không tăng trong 6 giờ đầu (duy trì ở mức hơn 36 g/L), sau đó tăng nhẹ và đạt nồng độ 41,8 g/L sau 24 giờ nuôi cấy. Hàm lượng ectoine trong pha I-2 cũng tăng mạnh từ 3,1% khi bắt đầu lên 8,4% sau 24 giờ. Cũng tương tự như pha II, sinh khối tế bào tiếp tục tăng nhẹ ở pha II-2 (47,5 g/L sau 15 giờ), ngược lại hàm lượng ectoine tăng mạnh và đạt 15,3% khi kết thúc pha II-2. Sinh khối tế bào tiếp tục được xử lý với dung dịch muối loãng để thu hồi ectoine. Đây là kết quả bước đầu thử nghiệm nghiên cứu xây dựng quy trình lên men và thu hồi ectoine.

Có thể tìm đọc toàn văn Báo cáo kết quả nghiên cứu của Đề tài (Mã số 18066/2020) tại Cục Thông tin khoa học và công nghệ quốc gia.

P.T.T (NASATI)