Tắc nghẽn mạch là tình trạng ứ đọng máu với huyết khối, có thể dẫn đến nhồi máu cơ tim cấp tính và đột quỵ do thiếu máu cục bộ, cả hai đều dẫn đến tử vong. Khác với sự can thiệp phẫu thuật để lấy hoặc thông tắc nghẽn, hoặc tạo ra mạch phụ để cấp máu mới, chỉ có giải pháp xử lý bằng cách uống thuốc thông tắc để tiêu huyết khối như streptokinase, t-PA (thể hoạt hóa plasminogen dạng mô), urokinase, staphylokinase và nattokinase là thực sự hiệu quả. Tuy nhiên, có một số hạn chế khi sử dụng các loại thuốc này như: (i) urokinase, streptokinase có tính đặc hiệu thấp với fibrin, chỉ hiệu quả khi dùng qua đường tiêm tĩnh mạch và thường không hiệu quả khi động mạch của bệnh nhân đột quỵ và đau tim đã chai cứng ở nhiều vị trí; (ii) t-PA thể hiện hoạt tính phân hủy fibrin mạnh nhưng t-PA có giá thành khá cao và thời gian bán phân hủy ngắn trong cơ thể; và (iii) t-PA và urokinase gây ra các tác dụng phụ không mong muốn như xuất huyết tiêu hóa và dị ứng. Riêng nattokinase, trong những năm gần đây, đã dành được sự quan tâm đặc biệt trong điều trị chứng nghẽn mạch do siêu khả năng làm tan huyết khối một cách an toàn, thời giai bán phân hủy dài và có hiệu lực qua đường uống như thuốc. Nattokinase có tác động mạnh hơn nhiều so với các thuốc làm tan huyết khối thông thường khác như urokinase, streptokinase và t-PA.

Ngoài ra, hoạt tính phân hủy huyết khối của nattokinase cũng cao gấp 4 lần so với Plasmin. Thực nghiệm đã cho thấy rằng nattokinase phân cắt chất ức chế hoạt hoá plasminogen dạng mô (PAI-1) dẫn tới việc loại bỏ hiệu quả cấu trúc huyết khối trong cơ thể. Đồng thời, được chứng minh có hiệu quả trong điều trị lâm sàng và không gây phản ứng phụ.

Hiện tại nhu cầu sản phẩm nattokinase tăng rất cao ở thị trường Nhật Bản và Đài Loan. Trong nước, các công ty dược phẩm cũng đã bắt đầu cho ra các sản phẩm nattokinase với nguồn nguyên liệu chủ yếu nhập từ Nhật Bản có giá thành khá cao. Vì vậy, việc chủ động được nguồn nguyên liệu nattokinase có hoạt lực cao và giá cả phù hợp là định hướng quan trọng cho ngành công nghệ hóa dược và thực phẩm của nước ta.

Trên một khía cạnh khác, bên cạnh nattokinase, một lượng lớn vitamin K2 đã hiện diện trong dịch chiết được thu hồi sau quá trình lên men sản xuất nattokinase của chủng vi khuẩn B. subtilis natto. Vitamin K2 được biết đến như là một thành phần cần thiết của hệ thống đông máu và có một số chức năng sinh lý khác. Sự thiếu hụt hàm lượng vitamin K2 sẽ gây rối loạn hấp thụ ở trẻ mới sinh và bệnh loãng xương ở người già. Tuy nhiên sự có mặt với một hàm lượng dư thừa vitamin K2 trong cơ thể sẽ gây nên bệnh thiếu máu do tán huyết, lách to, bệnh gan và bệnh thận. Đặc biệt đối với các bệnh nhân đang sử dụng thuốc ức chế tổng hợp các yếu tố đông máu liên quan với vitamin K để ngăn chặn chứng nghẽn mạch (như warfarin) thì việc đồng thời sử dụng thực phẩm chức năng nattokinase được sản xuất từ quá trình lên men tự nhiên chứa một hàm lượng lớn vitamin K2 nói trên đã khiến cho các thuốc này trở nên mất tác dụng. Vì vậy, để luôn đảm bảo vai trò ngăn chặn sự hình thành huyết khối trong phòng chống và điều trị chứng nghẽn mạch, thực phẩm chức năng nattokinase nhất thiết phải không chứa hoặc chứa một hàm lượng rất thấp vitamin K2.

Xuất phát từ những tồn tại và nhu cầu nói trên cũng như tiếp cận và ứng dụng các thành tựu đã đạt được về công nghệ sinh học phân tử trong nước và quốc tế, nhóm nghiên cứu do Cơ quan chủ trì Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN cùng phối hợp với Chủ nhiệm đề tài PGS.TS. Ngô Thị Tường Châu thực hiện: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất enzyme Nattokinase tái tổ hợp ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm”. Với mục tiêu xây dựng được quy trình công nghệ và mô hình thiết bị với công suất 100 lít dịch lên men/mẻ để sản xuất ít nhất 20 kg chế phẩm Nattokinase tái tổ hợp (hoạt lực 20.000 FU/g) và 50.000 viên nén (hoạt lực 1.000 FU/viên), đồng thời triển khai ứng dụng tại các cơ sở sản xuất trong nước góp phần nâng cao chất lượng, giảm giá thành sản phẩm, hướng đến việc thay thế một phần hoặc hoàn toàn nguồn nguyên liệu nattokinase nhập ngoại.

Sau thời gian nghiên cứu, đề tài đã thu được những kết quả như sau:

Tạo được chủng vi khuẩn Bacillus subtilis tái tổ hợp sinh nattokinase

- Đã tuyển chọn mới được 03 chủng vi khuẩn có hoạt tính nattokinase cao sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 37°C, pH 7,0 và nồng độ muối NaCl 1-2%.

- Đã định danh các chủng được tuyển chọn lần lượt là Bacillus subtilis Natto5, B. subtilis N39 và B. subtilis N53. Trình tự gen 16S rDNA của chúng đã được đăng ký trên Genbank với các mã số truy cập lần lượt là KR140153, KY000524 và KY000524.

- Đã tách chiết DNA tổng số của các chủng được tuyển chọn và chủng B. subtilis C10 (chủng có hoạt tính nattokinase đã biết) và khuếch đại thành công các gen mã hóa nattokinase.

- Đã tạo dòng gen mã hoá nattokinase từ chủng B. subtilis Natto5 (gen Nat05) và B. subtilis C10 (gen NatC10) vào vector pGEM-T easy.

- Trình tự nucleotide của các gen mã hóa nattokinase từ các chủng B. subtilis C10, B. subtilis Natto5, B. subtilis N39 và B. subtilis N53 có độ tương đồng cao với gen mã hoá nattokinase đã được công bố trên GenBank và đã đăng ký trên GenBank với các mã số lần lượt là KU341112, KU341115, KU341116 và KU341113.

- Đã đánh giá được sự đa dạng của các gen mã hóa nattokinase khi so sánh bằng phần mềm Clustal Omega. Trong đó, gen Nat05 và NatC10 có sự khác biệt hơn so với các chủng còn lại.

- Đã gắn thành công gen Nat05 và NatC10 vào các vector biểu hiện pHT43 và vector pAC7.

- Đã biến nạp thành công các thể tái tổ hợp pHT43/Nat05, pHT43/NatC10, pAC7/Nat05 và pAC7/NatC10 vào E. coli TOP10.

Xây dựng được quy trình công nghệ lên men chìm sản xuất chế phẩm nattokinase tái tổ hợp

- Đã tối ưu hóa môi trường và điều kiện lên men cho khả năng sinh tổng hợp nattokinase của chủng B. subtilis BD170 tái tổ hợp:

+ Môi trường lên men: môi trường MT2 tối ưu có thành phần gồm (g/l): Maltose 15,0; Đậu tương 45,0; MgSO4 0,75; CaCl2 0,75 (hạt đậu tương được ngâm với nước 6 giờ cho mềm và xay nhuyễn thành sữa để làm môi trường).

+ Điều kiện lên men là pH ban đầu của môi trường lên men: 7,0; nhiệt độ lên men: 35o C; tốc độ lắc: 200 vòng/phút; thời gian nhân giống: 24 giờ; lượng giống cần tiếp: 5%; và nuôi trong bình tam giác có 25% dịch lên men.

+ Thời điểm sau 48 giờ lên men trong môi trường và điều kiện lên men tối ưu, hoạt tính nattokinase của dịch lên men thu được có khả năng làm tan 64,5% huyết khối và đạt được cao nhất là 415 FU/ml.

+ Đã nâng cao hoạt tính nattokinase của chủng B. subtilis BD170 tái tổ hợp bằng các tác nhân vật lý và hóa học khi lên men trong bình thể tích 10-L (New Brunswick BioFlo®/CelliGen® 115, Eppendorf) chứa 5 lít môi trường.

+ Trong 12 giờ đầu lên men duy trì tốc độ khuấy 200 vòng/phút. Sau đó tăng tốc độ khuấy từ 200 vòng/ phút lên 300 vòng/phút, duy trì trong 24 giờ tiếp theo. Tại thời điểm 36 giờ giảm tốc độ khuấy xuống 200 vòng/phút, kéo dài tới hết quá trình lên men. Đồng thời tại thời điểm 36 giờ lên men bổ sung chất cảm ứng IPTG 1mM. Trước khi kết thúc quá trình lên men 30 phút nâng nhiệt độ của môi trường lên 45 độ C.

Đã xây dựng được quy trình công nghệ và mô hình thiết bị với công suất 100 lít dịch lên men/mẻ để sản xuất ít nhất 20 kg chế phẩm nattokinase tái tổ hợp (hoạt lực 20.000 FU/g) và 50.000 viên nén (hoạt lực 1.000 FU/viên), đồng thời có thể triển khai ứng dụng tại các cơ sở sản xuất trong nước góp phần nâng cao chất lượng, giảm giá thành sản phẩm, hướng đến việc thay thế một phần hoặc hoàn toàn nguồn nguyên liệu nattokinase nhập ngoại.

Có thể tìm đọc báo cáo kết quả nghiên cứu (mã số 16868/2019) tại Cục Thông tin KHCNQG.

Đ.T.V (NASATI)