Đột biến mất đoạn vùng AZF là nguyên nhân di truyền phổ biến đứng thứ hai, gây vô sinh ở nam giới. AZF (Azoospermia factor) nằm ở vùng đặc hiệu giới tính nam trên nhiễm sắc thể giới tính Y (NST Y), được gọi là yếu tố vô tinh hay yếu tố không có tinh trùng. Trên vùng AZF có chứa các gen quy định việc sản xuất, biệt hóa và trưởng thành tế bào sinh dục nam là tinh trùng.

Đột biến mất đoạn AZF hay còn gọi là đột biến mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể (NST) Y là bất thường cấu trúc hay gặp nhất trên NST Y dẫn đến người nam bị hạn chế hoặc không có khả năng sinh tinh tinh trùng. Năm 1999, Viện Nam học Châu Âu (EAA - European Academy of Andrology) và Mạng lưới chất lượng di truyền phân tử Châu Âu (EMQN - European Molecular Genetics Quality Network) đã tham gia tích cực trong việc hỗ trợ cải thiện chất lượng của các xét nghiệm mất đoạn nhỏ trên NST bằng việc xuất bản các cẩm nang hướng dẫn phòng thí nghiệm cũng như cung cấp các chương trình ngoại kiểm để đảm bảo chất lượng kết quả xét nghiệm. Theo EAA và EMQN, quy trình chẩn đoán mất đoạn nhỏ trên NST Y được thực hiện bằng phản ứng multiplex PCR (mPCR, PCR đa mồi), khuếch đại các vùng đặc hiệu trên NST Y áp dụng cho các bệnh nhân nam có chỉ số mật độ tinh trùng thấp hơn 5x106 /mL tinh dịch. Có khoảng 300 STS đặc hiệu cho vùng AZF có thể sử dụng cho chẩn đoán mất đoạn nhỏ, tuy nhiên nếu sử dụng tất cả các STS này cho chẩn đoán sẽ rất mất thời gian và tốn kém. Về mặt nguyên tắc, chỉ cần phân tích 1 STS trong từng vùng AZF là đủ để xác định mất đoạn trong các vùng AZFa, AZFb, AZFc. Tuy nhiên phân tích hai STS trong mỗi vùng sẽ làm tăng độ chính xác của chẩn đoán. Do đó, EAA khuyến cáo chỉ cần sử dụng 2 STS cho phát hiện mất đoạn nhỏ ở mỗi phân vùng (độ chính xác của xét nghiệm lên tới 95%).

Các nghiên cứu gần đây phát hiện thêm các vị trí đại diện cho các vùng AZF abc, ngoài 6 vị trí cơ bản đại diện cho 3 vùng AZFa, AZFb và AZFc, còn có thêm 11 đến 13 STS thuộc vùng AZF mở rộng, nhằm phát hiện các đột biến mất đoạn hoàn toàn cho AZFabc. Năm 2018, Lương Thị Lan Anh và cộng sự trong nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật hoàn chỉnh mất đoạn AZF mở rộng với 19 trình tự STS bằng kỹ thuật QF-PCR đã phát hiện tỉ lệ mất đoạn tăng lên khá cao khi rà soát được 6 STS thuộc vùng cơ bản của AZFabc và 13 STS thuộc vùng AZF mở rộng, tỉ lệ mất đoạn ở nam giới vô sinh không có tinh trùng là 40%, trong đó vùng AZF cơ bản là 16,7%, vùng AZF mở rộng là 83,3%. Khi mất các phân đoạn khác nhau hoặc các kiểu mất đoạn khác nhau sẽ cho những biểu hiện lâm sàng khác nhau, việc này liên quan chặt chẽ đến quá trình tư vấn sinh sản và hỗ trợ sinh sản. Vì vậy việc nghiên cứu những phân đoạn bị mất và kiểu mất đoạn rất quan trọng đến vấn đề điều trị và tư vấn bệnh nhân. Với tỉ lệ mất đoạn AZF chiếm đa số trong nguyên nhân gây vô sinh nam giới, phân tích mất đoạn nhỏ trên NST Y tại vùng AZF là xét nghiệm đầu tay của các nhà nam khoa, sản phụ khoa và di truyền trong chẩn đoán vô sinh nam giới.

Hiện nay trong nước chưa có bộ kit chẩn đoán mất đoạn AZF, các phòng xét nghiệm chủ yếu thực hiện bằng phương pháp thủ công, tốn nhiều thời gian và chất lượng luôn phải kiểm soát. Các bộ kit chẩn đoán AZF có nguồn gốc ngoại nhập. Phương pháp Real-time PCR và QF-PCR trong các bộ kit ngoại nhập được tối ưu trong 1-2 phản ứng, nhưng kỹ thuật phức tạp và giá thành rất cao. Các công ty kinh doanh thương phẩm y tế chủ yếu chào bán bộ kit Devyser (v2 và Extension) cho 17 STS - phát hiện mất đoạn AZF vùng cơ bản và mở rộng, tuy nhiên giá thành khá cao. Do đó, nhằm hoàn thiện công nghệ để xây dựng quy trình kỹ thuật mPCR cho phát hiện 17 STS chỉ với 3 phản ứng trong 1 lần thực hiện, đồng thời phát triển thành bộ kit chẩn đoán đột biến AZF, nhóm nghiên cứu do PGS. TS. Lương Thị Lan Anh đứng đầu, Trường Đại học Y Hà Nội, đã thực hiện dự án: “Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất bộ kit chẩn đoán đột biến gen AZF gây vô sinh nam giới” với mục đích tạo ra 1 bộ kit chẩn đoán mất đoạn AZF đạt được tiêu chí chất lượng đảm bảo và giá thành hợp lý, số lượng STS đặc trưng cho các đột biến liên quan đến bệnh vô sinh ở nam giới, đại diện cho quần thể người Châu Á nói chung và người Việt Nam nói riêng, đồng thời các STS này cần phải phù hợp với công bố và khuyến cáo của EAA/EMQN và kỹ thuật thực hiện tiện dụng cho người làm xét nghiệm.

Công nghệ mà dự án thực hiện là ứng dụng kỹ thuật mPCR để xác định 17 STS, bao gồm 6 STS thuộc vùng AZF cơ bản và 11 STS thuộc vùng AZF mở rộng. Các trình tự đại diện cho vùng AZFa là: sY82, sY83, sY84, sY86, sY88, sY1182, trong đó 2 trình tự sY84, sY86 được xác định là đại diện chính, gọi là vùng AZFa cơ bản, các trình tự còn lại gọi là AZFa mở rộng. Các trình tự đại diện cho vùng AZFb: sY105, sY121, sY127, sY134, sY143, trong đó 2 trình tự sY127 và sY134 được xác định là đại diện chính, gọi là vùng AZFb cơ bản, các trình tự còn lại gọi là AZFb mở rộng. Các trình tự đại diện cho vùng AZFc: sY254, sY255, sY1191, sY1192, sY160, sY153, trong đó 2 trình tự sY254 và sY255 được xác định là đại diện chính, gọi là vùng AZFc cơ bản, các trình tự còn lại gọi là AZFc mở rộng. Dự kiến mỗi mẫu xét nghiệm được thực hiện trong 3 phản ứng mPCR. Kỹ thuật mPCR là 1 trong các kỹ thuật di truyền phân tử được ứng dụng trongphát hiệnđột biến gen có có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thực hiện đơn giản, chi phí xét nghiệm hợp lý và không đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền. Do có nhiều vị trí STS trên vùng AZF cần phát hiện, hiện nay các kit chẩn đoán mất đoạn AZF hay các nghiên cứu tối ưu ứng dụng kỹ thuật mPCR thường chỉ giới hạn trong 1 phản ứng mPCR phát hiện đồng thời 3 - 4 STS. Do đó, nếu phải phát hiện đồng thời 17 STS cần tới 6 đến 7 phản ứng trong 1 lần thực hiện, tốn nhiều thời gian.

Sau một thời gian triển khai thực hiện, đề tài đưa ra các kết luận như sau:

1. Đã hoàn thiện được quy trình công nghệ sản xuất bộ kit chẩn đoán AZF gây vô sinh nam giới

 - Quy trình sản suất tạo bộ kit AZPA, có tên thương mại là: LightPoweriVAmAZF Human PCR Kit VA. A02-997B;, mỗi bộ kit gồm 2 hộp AZPA_D (VA.A02- 997B.1) và AZPA_E (VA.A02-997B.2), trong đó: AZPA_D để phát hiện mất đoạn của 6 STS cơ bản của vùng AZF là: sY84, sY86 (AZFa), sY127, sY134 (AZFb), sY254, sY255 (AZFc). AZPA_E để phát hiện mất đoạn của 11 STS mở rộng của vùng AZF là: sY88, sY121, sY1182, sY105, sY1191, sY1291, sY153, sY160, sY82, sY143, sY83.

- Các bộ kit được sản xuất từ quy trình này đã được xác định độ nhạy và độ đặc hiệu so với kit thương mại của Thụy Điển Devyser v2 và Extension.

2. Bộ kit AZPA đạt tiêu chuẩn cơ sở

- Được cấp chứng nhận thẩm định tiêu chuẩn cơ sở bởi Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế.

- Bộ kit AZPA_D đạt độ nhạy và độ đặc hiệu là 100% so với bộ kit thương mại dành cho chẩn đoán (IVD). Bộ kit AZPA_E đạt độ nhạy và độ đặc hiệu 100% so với bộ kit thương mại dành cho chẩn đoán. Bộ kit có độ ổn định 12 tháng.

- Bộ kit AZPA đạt độ nhạy 100% khi thực hiện phân tích đơn mồi (tiêu chuẩn vàng) cho các STS bị mất đoạn.

3. Đã hoàn thiện quy trình quy mô công nghiệp sản xuất bộ kit AZPA

- Quy trình SOP đã được Hội đồng khoa học thông qua và đạt yêu cầu, áp dụng tại phòng sản xuất Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á.

- Công suất: 300 kit/mẻ.

- Đã có 300 bộ kit LightPoweriVAmAZF Human PCR Kit VA. A02-997B.

- 10 bộ kit sản xuất từ quy trình quy mô công nghiệp đã được thẩm định tiêu chuẩn cơ sở đạt chất lượng.

Có thể tìm đọc toàn văn Báo cáo kết quả nghiên cứu của Đề tài (Mã số 18946/2020) tại Cục Thông tin khoa học và công nghệ quốc gia.

P.T.T (NASATI)